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4 Erneute Denaturierung Die neu synthetisierten Ketten werden wieder bei 96°C geschmolzen und ermöglichen eine wiederholte Anlagerung von Primern. 2. 5 Erneute DNA-Synthese An alle einzelsträngigen DNA-Moleküle kann die Polymerase erneut ansetzen und Doppelstränge synthetisieren. Dabei entstehen nur an der ursprünglichen DNA wieder Fragmente zufälliger Länge, während bei den synthetisierten Nukleinsäuren die Polymerisation des Gegenstranges am Beginn des ursprünglichen Primers endet. 2. Polymerase kettenreaktion arbeitsblatt in e. 6 Repetition des Vorgangs Der Ablauf von Schmelzen, Primer-Bindung und Synthese kann so lange wiederholt werden, bis die benötigte DNA-Menge hergestellt ist. Dabei entstehen in exponentieller Menge DNA-Fragmente einer bestimmten Länge, die für weitere gentechnische Experimente verwendet werden können. 3 Anwendungen Die Anwendungen der PCR sind vielfältig: Sie wird gerichtsmedizinisch bei Abstammungsgutachten oder bei der Analyse von am Tatort gewonnenem genetischem Material ( Genetischer Fingerabdruck) ebenso verwendet wie bei der Diagnose von Erbkrankheiten aus Blutproben oder Chorionzottenbiopsie -Material.
Mullis erhielt von seiner Firma die lächerlich geringe Summe von 10. 000 Dollar als Anerkennung für seine Erfindung. Später verkaufte diese Firma das PCR-Patent für 3 Millionen Dollar weiter (aus heutiger Sicht auch eine sehr geringe Summe für eine solch wichtige Erfindung). 1993 erhielt Mullis dann aber den Nobelpreis für Chemie, so dass er doch noch eine angemessene Anerkennung für seine Erfindung erhielt. Grundprinzip der PCR 1. Denaturierung Bei 95°C wird die doppelsträngige DNA, die vervielfältigt werden soll, aufgeschmolzen (in Einzelstränge gespalten). Aufschmelzen der DNA Autor: Ulrich Helmich 2022, Lizenz: siehe Seitenende Die H-Brücken, welche die Basenpaare zusammenhalten, sind zwar einzeln betrachtet nur sehr schwach, in ihrer Gesamtheit jedoch entwickeln die vielen H-Brücken eines Doppelstrangs eine ganz schöne Bindungskraft. Polymerase-Kettenreaktion - DocCheck Flexikon. Proteine denaturieren bereits bei 40 oder 50 ºC, während die DNA erst bei über 90 ºC aufschmilzt. 2. Anlagerung der Primer Die beiden DNA-Primer-Moleküle, die schon vorher zugesetzt worden sind, lagern sich bei 60°C an die Einzelstränge an.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR - Polymerase-Chain-Reaction) ist ein künstliches Verfahren zur Vervielfältigung von DNA. Praktische Anwendung findet sie etwa bei Vaterschaftstests, Untersuchung des genetischen Fingerabdrucks bei Kriminalverbrechen oder zum Nachweis von Krankheiten (genetische Krankheiten als auch Virusinfektionen) In einem sogenannten Thermocycler wird die zu vervielfältigende DNA mit freien Nukleotiden, DNA-Polymerasen und speziellen Primern zusammengebracht. Der Thermocycler ermöglicht dann einen automatischen Ablauf der PCR, denn es sind mehrere Zyklen notwendig bis genügenden DNA vervielfältigt wurde. Bereits ein DNA-Doppelstrang genügt, um das Verfahren anzuwenden. Polymerase kettenreaktion arbeitsblatt 3. Pro Zyklus steigt die Zahl der DNA-Doppelstränge dann exponentiell an (1-2-4-8-16 usw. ), sodass nach 30-50 Zyklen genügend Erbgut zur Verfügung steht. Jedoch werden bei der Polymerase-Kettenreaktion keine kompletten DNA-Doppelstränge vervielfältigt, sondern nur zuvor festgelegte Teilabschnitte. Diese Teilabschnitte kann man sehr präzise durch künstlich synthethisierte Primer festlegen.
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Ausgehend von der DNA-Replikation in der Zelle, entwickelte Kary Bank Mullis ein Verfahren, das DNA im Reagenzglas ( in vitro) durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mithilfe des Enzyms DNA-Polymerase vervielfältigt. Die DNA-Polymerase bindet sich an den DNA-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang (= DNA-Replikation). In der PCR ist die DNA-Polymerase das einzige verwendete Enzym, alle anderen Schritte können ohne enzymatische Hilfe im Reagenzglas umgesetzt werden. Ablauf der PCR. DNA kann in vitro milliardenfach vervielfältigt werden. Merke Hier klicken zum Ausklappen Schritte der PCR: Denaturierung -> Primer-Annealing -> Primer-Extension -> Denaturierung... Polymerase kettenreaktion arbeitsblatt 1. Tabelle: Vergleich DNA-Replikation vs. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Reaktionsschritt DNA-Replikation (in vivo = in der Zelle; Bsp. : E. -coli -Bakterien) PCR (in vitro = im Reagenzglas) Öffnen des DNA-Doppelstranges DNA-Helikase Denaturierung: Erhitzen der DNA auf 95 °C öffnet die Wasserstoffbrückenbindungen und führt zu Einzelsträngen Startermolekül erzeugen Primase (entspricht einer RNA-Polymerase); Primer material ist aus RNA-Nukleotiden gebildet!
Die PCR wird heute üblicherweise apparativ in einem Thermocycler durchgeführt. Sie läuft in mehreren Schritten ab: 2. 1 Denaturierung Durch Erwärmung des Versuchs- Assays auf bis zu 96° C wird die DNA denaturiert, indem die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden Ketten der zu vervielfältigenden DNA gespalten werden. Die Nukleinsäure liegt danach einzelsträngig vor. 2. 2 Primer-Bindung Beim Annealing bzw. der Primerhybridisierung wird der Versuchsansatz auf ungefähr 55 bis 65°C abgekühlt und die Primer binden jeweils an das 3'-Ende der Gensequenz. Die konkrete Temperatur hängt dabei von der Nukleinsäuresequenz und -länge der verwendeten Primer ab. 2. 3 Polymerase-Bindung und DNA-Synthese Während der Elongation synthetisiert die Polymerase bei einer Temperatur von ca. 72°C vom Primer aus in 5'-3'-Richtung den komplementären Strang. Beim ersten Durchgang entstehen Ketten variabler Länge, da die Polymerase nach der Replikation einer zufälligen Anzahl von Basenpaaren die Synthese abbricht. 2.